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貢菊不同花期3種活性物質含量及相關基因表達

2019-11-13 03:11:12 江蘇農業科學 2019年17期

岳圓圓 全英杰 任鏝蓉

摘要:研究貢菊花蕾期、露白期、初花期和盛花期中木樨草苷、綠原酸和異綠原酸含量及其相關CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因相對表達量的變化,為確定貢菊最佳采收時期提供理論依據。結果表明,綠原酸、木樨草苷和異綠原酸的含量都在露白期迅速下降,初花期上升,盛花期逐漸下降,其中在初花期含量最高,分別為 0.43%、0.27%和0.33%。利用實時熒光定量PCR檢測CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因的相對表達量發現,這些基因表達量變化呈現出橫向“S”形,并在初花期達到最高值,與木樨草苷、綠原酸、異綠原酸含量的變化趨勢相似,進一步表明貢菊在初花期木樨草苷、綠原酸、異綠原酸含量最高。

關鍵詞:綠原酸;木樨草苷;異綠原酸

中圖分類號: S682.1+10.1 ?文獻標志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)17-0165-04

菊花[Chrysanthemum morifolium (Ramat) Tzvel.]為菊科多年生草本植物,具有較高的觀賞價值和藥用價值,根據菊花的用途可分為觀賞性菊和功能性菊。功能性菊包括藥用菊、茶用菊和食用菊3種[1]。貢菊是功能性菊花栽培的主要品種之一,其朵大瓣寬,中心為黃色,蒂呈綠色,生長在安徽省南部海拔較高的山區,貢菊不僅是茗飲佳品,還是名優藥材。《中華人民共和國藥典》規定綠原酸、異綠原酸和木樨草苷為藥用菊的主要成分[2]。綠原酸、異綠原酸和木樨草苷都是通過苯丙氨酸代謝途徑合成的,木樨草苷合成的直接前體是p-香豆酸酰CoA和3-丙二酰CoA,在一系列酶的催化作用下最終合成木樨草苷,其中關鍵的合成酶是黃酮合成酶(flavone synthase,簡稱FNS)[3];香豆酸-3-羥化酶(p-coumarate-hydroxylase,簡稱C3H)和羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉移酶(hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase,簡稱HQT)等為綠原酸和異綠原酸合成的關鍵酶[4],編碼這些酶的基因表達也同樣反映物質的積累,在咖啡中HQT、C3H、HCT等基因的表達量增加,綠原酸含量也隨之增加[5],這些編碼酶的功能基因表達主要受到植物發育期和外界環境等因素的影響。

不同的采收時間對藥用菊主要活性成分含量的影響較大,陳志蓮報道,野菊從花蕾期到盛開期黃酮含量逐漸降低[5];梁迎暖等研究顯示,隨著懷菊花期的到來,黃酮和綠原酸含量呈現先升高后下降的變化,最佳的采收時期為70%的花開放時期[6];楊俊等檢測了杭白菊黃酮和綠原酸含量的變化,結果發現,綠原酸含量未發生變化,黃酮含量隨采收期推遲呈下降趨勢[7]。由此可見,不同菊花品種在不同采收時期的活性物質含量變化不同。目前,關于貢菊采收時期與活性物質含量變化關系的研究未見報道。因此,本試驗以貢菊為材料,研究花蕾期、露白期、初開期和盛開期4個時期花序中綠原酸、木樨草苷和異綠原酸含量的變化及其關鍵基因的表達量,為確定貢菊最佳采收期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將貢菊扦插苗移栽到含腐殖土、珍珠巖(體積比為3 ∶ 1)的花盆中,移到延邊大學農學院溫室進行培養,溫度為(25±2) ℃,相對濕度為70%。貢菊現蕾后按照蕾期、露白期、初花期和盛花期選擇頂芽花進行采集(圖1),放到液氮中帶回

實驗室,于 -80 ℃ 超低溫冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制備 稱取綠原酸、木樨草苷和異綠原酸各1.5 mg,分別加入1.95 mL 70%的甲醇溶液,振蕩搖勻,使其充分溶解,獲得標準對照品母液(0.769 mg/mL),再將其配制成0.25 mg/mL的混合對照標準品母液,分別將其稀釋成濃度為0.250、0.200、0.125、0.100、0.062、0.031和 0.017 mg/mL 的7種不同濃度的混合標準對照品溶液,用高效液相色譜儀(Agilent 1260)進行分析。色譜條件如下:以乙腈為流動相A,0.1%磷酸溶液為流動相B,梯度洗提程序為 0~11 min,10%~18% A;11~30 min,18%~20% A;30~40 min,20% A;40~45 min,20%~10% A;流速為1 mg/mL,檢測波長為350 nm,柱溫為40 ℃,進樣量為5 μL。記錄峰面積,以各標準濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,計算綠原酸、木樨草苷和異綠原酸含量的線性關系。

1.2.2 樣品溶液的制備與測定 取不同花期的干燥樣品,分別用打碎機打碎,稱取樣品粉末0.25 g,分別置于具塞錐形瓶中,加入25 mL 70%色譜級甲醇溶液,蓋上塞子,封閉放置。超聲處理(120 W,40 kHz)40 min,冰浴冷卻至室溫,5 000 r/min 離心30 min,上清用旋轉蒸發儀濃縮處理,冷卻至室溫,用2.5 mL 70% 色譜級甲醇溶液溶解,取溶液經微孔濾膜過濾后測定。

1.2.3 貢菊RNA的提取及反轉錄 采用RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)分別提取貢菊不同花期的RNA,采用NanoDrop ND-2000型微量核酸蛋白定量測定儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]測定RNA濃度和質量。利用反轉錄試劑盒(天根生化科技有限公司),按照說明書將1 000 ng RNA合成cDNA第1鏈,于-20 ℃保存備用。

1.2.4 相關基因的表達分析 根據菊花轉錄組數據,分別找到CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因的序列,并在3′端序列設計特異性引物FNS1-F、FNS1-R、C3H-F、C3H-R、HQT-F、HQT-R(表1),采用熒光定量PCR儀(Agilent 3005)進行定量分析,反應程序如下:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,40個循環。最后加入溶解曲線程序,以EF1α基因為內參,每個樣品重復3次,采用2-ΔΔCT公式計算基因相對表達量。

1.3 數據分析

每個試驗處理設3次重復,數據用SPSS 11.0軟件進行統計分析,采用鄧肯氏新復極差法作顯著性差異分析,顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 綠原酸、木樨草苷和異綠原酸標準曲線

將綠原酸、木樨草苷和異綠原酸標準樣品配成不同濃度,分別取5 μL進樣分析,分別以峰面積、質量濃度為縱、橫坐標繪制標準曲線,得到回歸方程(圖2)。綠原酸的回歸方程為y=4 521.6x+3.851 5(r2=0.998 7),木樨草苷的回歸方程為y=22 136x-130.83(r2=0.992 8),異綠原酸的回歸方程為y=12 521x-50.123(r2=0.997 1),標準曲線在標準品濃度范圍內線性良好。

2.2 不同花期綠原酸、木樨草苷和異綠原酸的含量分析

貢菊在花蕾期、露白期、初花期和盛花期時綠原酸、木樨草苷和異綠原酸含量發生較大變化(圖3)。綠原酸含量在花蕾期和初花期較高,分別為0.33%和0.43%,在露白期和盛花期較低;木樨草苷在花蕾期和露白期含量較低,初花期含量達到最高值,為0.27%,在盛花期含量又下降;異綠原酸含量同樣也在初花期最大,為0.33%,其次是花蕾期和盛花期。貢菊中綠原酸、木樨草苷和異綠原酸的含量都在初花期時最高。

2.3 CmFNS1、CmHQT和CmC3H基因的相對表達量

CmFNS1是木樨草苷合成的關鍵基因,它編碼黃酮合成酶。由圖4可見,CmFNS1在貢菊花蕾期的相對表達量最高,露白期表達量降低,初花期表達量升高,盛花期表達量降低,呈現橫向“S”形,這與不同花期木樨草苷含量的變化相一致;CmHQT和CmC3H分別編碼羥基肉桂酰輔酶A奎尼酸轉移酶和香豆酸羥化酶,是綠原酸和異綠原酸合成的關鍵酶,CmHQT和CmC3H基的因相對表達量在花蕾期最高,露白期迅速降低,初花期相對表達量緩慢升高,盛花期逐漸降低,CmHQT和CmC3H相對表達量的變化趨勢與綠原酸和異綠原酸含量的變化趨勢相似。

3 討論與結論

3.1 綠原酸、木樨草苷和異綠原酸在不同花期含量的變化

藥用菊的主要活性物質為綠原酸、木樨草苷和異綠原酸等,影響這些活性物質含量的主要有品種、采收期、氣候條件等。劉莉等研究杭菊、貢菊和亳菊3種藥用菊花時發現,亳菊中木樨草素含量最高[8];魏民等研究發現,野菊花中的菊花苷含量在花蕾期、初花期、盛花期、末花期中逐漸下降[9];劉沁等發現,雪菊在采收中期時總黃酮含量最高,而在采收末期時綠原酸含量最高,總酚含量卻在采收初期最高[10]。在這些

影響因素中,采收期對活性物質影響較大而且容易調控。本研究發現,貢菊在不同采收期(花蕾期、露白期、初花期和盛花期)綠原酸、木樨草苷和異綠原酸活性物質含量均不同,都在初花期最高。貢菊花蕾期單花干質量低于盛花期干質量,單花木樨草苷、綠原酸含量在盛花期時分別為182、262 μg/mg,在初花期時分別為271、439 μg/mg,盛花期均小于初花期。并且盛花期的貢菊花色變淡,有些花粉散落,影響菊花品質,而初花期采摘后的貢菊,側枝萌發的花朵比盛花期采收的側枝花朵更大些,因此建議貢菊在初花期采摘。

3.2 綠原酸、木樨草苷和異綠原酸合成相關基因的表達

綠原酸、異綠原酸和木樨草苷合成都通過苯丙氨酸代謝途徑,主要受到PAL、C3H、CHS、FNS、C3H、HQT等結構基因的表達影響。FNS包括黃酮合成酶Ⅰ(FNSⅠ)和黃酮合成酶Ⅱ(FNSⅡ)。FNSⅠ是一種可溶性的2-酮戊二酸和依賴Fe2+的雙加氧酶,催化黃烷酮轉化為黃酮,主要存在于傘形科中[11],最近也在水稻和擬南芥中發現[12-13]。FNSⅡ屬于細胞色素P450,它依賴于NADPH和氧分子的膜結合成單氧化酶,催化黃烷酮C-2和C-3之間形成雙健轉化為黃酮,存在于大多數植物中。在大豆[14]、水稻[15]、金銀花[16]中超表達FNS基因,可促進黃烷酮合成黃酮(5,7-二羥基黃酮、芹黃素和木樨草素)。本研究發現,貢菊含有FNS1和FNS2,FNS1在不同花期的相對表達量變化與木樨草苷含量一致,FNS2的相對表達量未發生變化,這可能由于FNS2不參與木樨草苷合成。張靜茹等研究發現,金銀花愈傷組織中綠原酸的量隨HQT基因表達量的升高而升高,C3H基因能夠催化苯丙烷類代謝產物C3位置的羥基化,是苯丙烷類代謝中的1個關鍵酶,可參與多種苯丙素類代謝產物的合成,如木質素、綠原酸、迷迭香等[17]。熒光定量PCR檢測結果顯示,C3H和HQT相對表達量變化趨勢與綠原酸和異綠原酸含量相似,這表明C3H和HQT參與綠原酸和異綠原酸合成。此外,還發現FNS1、C3H和HQT的相對表達量在花蕾期最高,而相應的木樨草苷、綠原酸和異綠原酸含量在初花期最高,這還需要進一步研究。

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